蓝白斑筛选原理及作用(蓝白斑筛选作用机理)
蓝白斑筛选作用机理
蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法。
解释蓝白斑筛选的原理
PCR 分子克隆 核酸电泳、琼脂糖凝胶电泳 测序 DNA,RNA 提取 转化外源DNA 体外转录、逆转录 cDNA文库构建 原位杂交、酵母双杂交、差减杂交、扣除杂交 蓝白斑筛选、抗生素筛选 基因工程技术大部分都是依据分子生物学原理设计出来的.
蓝白斑筛选的作用机理
分子生物学技术：
PCR、分子克隆、核酸电泳、琼脂糖凝胶电泳测序、DNA, RNA 提取、转化外源DNA、体外转录、逆转录、cDNA文库构建、原位杂交、酵母双杂交、差减杂交、扣除杂交、蓝白斑筛选、抗生素筛选 、基因工程技术大部分都是依据分子生物学原理设计出来的。
分子生物学的基本含义
分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。
所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、 生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。
简述蓝白斑筛选的机理
载体带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
蓝白斑筛选的基本原理
载体带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
蓝白斑筛选的原理
先连接T载体是为了提高转化效率
一般来说市面上出售的T载体都进行了优化，容易连接片段（也就是效率较高），因此构建表达载体时有时会先连接T载体。同时T载体的测序引物比较明确（商业化的缘故），因此测序也方便一些。更重要的是，T载体往往设计了蓝白斑筛选的功能，插入片段的载体会呈现白色，这样也容易区分验证，不用每个单菌落都拿去做colony PCR或提质粒酶切验证。
当然也不是绝对的，我们实验室就经常直接把片段酶切后连接表达载体，不经过T载体这一步，其实影响并不大。如果你的情况比较特殊（比如片段较大，或是对应的表达载体拷贝数较低等），可以考虑连接T载体，不然的话不是非常必要。
阐述蓝白斑筛选的原理及其应用
载体带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
蓝白斑筛选法原理
离心技术：
是分离纯化蛋白质、酶、核酸（DNA、RNA）、细胞的最常用方法之一。
电泳（electrophoresis）：带电粒子在电场中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。
可用于分离不同分子量的生物大分子。
1.蛋白质的电泳：
用途：蛋白质的定量。
2.核酸的电泳：
用途：用于核酸的分离、鉴定、纯化、回收。
比如：我只需要长度300bp左右的分子。那么，电泳后，在切胶过程中，只切300bp处的分子即可。
蛋白质研究相关的技术：
1. 含量测定：
2. 结构的测定：
（1）一级结构的测定：搞清楚蛋白质肽链的氨基酸排列顺序。
方法：Edman降解法、质谱法（MS, 将蛋白水解，多肽链分成小段。检测肽段）
（2）空间结构测定：蛋白空间结构分析比一级结构分析复杂得多。
方法：X射线衍射晶体分析法、核磁共振法等。
3. 功能的测定：
（1）酵母双杂交（YTH）：
假设：欲检测蛋白X与蛋白Y是否相互作用。
检测方法：
将蛋白X与报告基因转录因子的BD融合；
将蛋白Y与AD融合；
确认蛋白X与蛋白Y形成的复合体能否激活报告基因的表达。如果能激活报告基因的表达，说明：X与Y形成了复合体，则BD和AD靠近，激活了下游报告基因的表达；反之，报告基因不表达。
原理：
真核生物的转录因子（尤其是酵母转录因子GAL4），包括两个彼此分离、但功能必需的结构域：一个是与DNA结合的结构域-BD；一个是转录激活域-AD。BD识别转录因子效应基因的上游序列并与之结合；AD通过与转录复合体的其他成分作用，启动下游的基因转录。
即使BD与AD分开，但如果在空间上较为接近时也能激活转录。——利用转录因子的BD、AD这一特性，通过检测转录因子是否启动了其效应基因的表达，可研究蛋白质X与Y是否相互作用。
（2） 蛋白质芯片技术：一种高通量、微型化、自动化的蛋白质分析技术。一次试验中可同时检测几百甚至几千种目标蛋白或多肽。
（3）免疫印迹技术 Western blotting：利用抗原抗体特异反应的原理。
用途：检测样品中特定蛋白质是否存在以及半定量分析、研究蛋白质间的相互作用。