层析的装置和作用(层析技术的用途及特点)

层析技术的用途及特点

亲和层析特点

（1）简单，快速,

（2）回收率和纯化倍数高

（3）配基对相对应的蛋白质一般有稳定作用

（4）亲和性吸附剂可反复使用。

（5）层析柱中流动状况复杂，凝胶颗粒内传

质阻力大，达到吸附平衡的时间长

（6）亲水性载体的机械强度低，放大困难，处理量小

层析技术的作用

量子层析在量子光学、量子计算和量子信息等领域有着重要应用。

在光学系统中，量子层析可以通过测量光场体系中每个自由度的演化获得光子态的维格纳函数和密度矩阵，由此确定体系的全部量子态信息。

伴随着超快电子衍射和X射线衍射技术，特别是电子加速器和X射线自由电子激光对于时间分辨的分子波包测量技术的发展和进步，量子层析在分子体系中的应用得到广泛关注。

量子层析能够给出超越分子经典“球棍模型”的描述，直观地体现量子理论下分子运动的本质。

然而，目前对于超过一维的体系来说，尚不能由分子波包几率密度重建密度矩阵，这直接限制了对分子转动自由度和大部分振动自由度的分析，从而限制了量子层析的应用范围。

层析技术的应用

荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。

层析技术可应用于哪些方面

层析基本原理：

层析须在两相系统间进行。一相是固定相，需支持物，是固体或液体。另一相为流动相，是液体或气体。当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间的分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经历吸附和解吸的过程。随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动的速率差异，由开始的单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层。

系数K是物质在两相中的浓度比。K值大，则在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物质间的K值差别大，则易被分离。不同类型层析的K值含义不同，可视为吸附平衡常数，分配常数或离子交换常数等。

层析技术的用途及特点有哪些

1、根据蛋白的特性，一般可以有以下5种纯化方法。目前平台配备的主要是前四种层析纯化的各种凝胶柱。反相层析技术在一般的蛋白纯化中较少使用，下面将详细介绍常用的前四种层析技术原理及特点。

2、凝胶过滤层析，根据大小和形状分离，这种分离方式是非吸附性的，整个分离过程中只需要一种缓冲液，实验操作方便。在峰谱图中，出峰顺序是：大分子先流出层析柱，小分子后出。

3、离子交换层析，不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正／负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。离子交换层析属于吸附性分离方式，纯化过程中它具有可逆、操控性强及实现样品浓缩等特点。在精纯实验中是常与其它方法相结合使用的主要技术。

4、亲和层析，通过生物分子之间的特异性相互作用来实现分离的层析方法。亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。

5、疏水相互作用层析，依据生物分子间疏水性差别实现分离的一种层析方式。高离子强度下，增进蛋白质中的疏水性氨基酸与层析介质间的疏水性相互作用，削弱其静电作用力。洗脱时，降低流动相离子强度，削弱蛋白质分子与层析介质间的疏水作用，实现目的蛋白的纯化和收集。

6、疏水作用层析也属于吸附性分离方式，对具有疏水特性的目的蛋白具有高选择性和浓缩等特点。

三种常见的层析技术

氧化铝填料的分离原理是物理吸附，即：氧化铝对不同极性物质的吸附能力不同，从而达到分离效果

氧化铝本身显一定的碱性，能抑制碱性物质的电离，保持其游离状态，故对碱性物质较好的分离效果； 若分离酸性物质，则与之成盐，会产生拖尾，难以分离

大孔树脂主要起分子筛的作用，适用于分离糖类大分子物质

固相萃取适用于液相色谱之前的样品预处理，使样品更干净

中性氧化铝适用于醛 醌 酮 某些苷 及酸碱溶液中不稳定的化合物如酯 等化合物的分离

柱色谱中常用的吸附剂有：

⑴氧化铝： 市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规格大多为100~150目。

碱性氧化铝 (pH 9-10）适用于碱性物质 （如胺、生物碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。

酸性氧化铝 (pH 3.5-4.5）适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等的分离。

中性氧化铝 (pH 7-7.5）适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。

⑵硅胶： 硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2·xH2O，又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。

⑶聚酰胺： 聚酰胺是聚己内酰胺的简称，商业上叫做锦纶、尼龙-6或卡普纶。色谱用聚酰胺是一种白色多孔性非晶形粉末，它是用锦纶丝溶于浓盐酸中制成的（制法详见附录十）。不溶于水和一般有机溶剂，易溶于浓无机酸、酚、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中。聚酰胺分子表面的酰氨基和末端胺基可以和酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成强度不等的氢键，因此可以分离上述化合物，也可以分离含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。

⑷硅酸镁： 中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间，主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。

层析技术的种类有哪些

层析法又称色层分析法或色谱法，是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。

例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的

层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用

层析根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。其中纸层析是指以滤纸作为基质的层析。

层析技术的种类及其基本原理

柱层析原理: 柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。

当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。 硅胶柱层析流动相： 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸 一般都是利用极性相似相容原理，看流动相与固定相的极性，大部分是固定相的极性小于流动相，然后流动相的极性与所要洗脱的物质极性比较接近，从而将物质洗脱下来。

层析技术的用途及特点是什么

亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。

1.抗原和抗体

利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。

例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。

将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 8-10? 12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。

另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。

2.生物素和亲和素

生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强,其解离常数为10 15M,洗脱通常需要强类的变性条件,可以选择biotion的类似物,如2-iminobiotin、diiminobiotin等降低与avidin的亲和力,这样可以在较温和的条件下将其从avidin上洗脱下来。

另外,可以利用生物素和亲和素间的高亲和力,将某种配体固定在基质上。例如将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖作用,通过生物素与亲和素的亲和力,胰岛素就被固定在琼脂糖上,可以用于亲和层析分离与胰岛素有亲和力的生物大分子物质。这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与CNBr活化的琼脂糖上更稳定。很多种生物大分子可以用生物素标记试剂(如生物素与NHS生成的酯)作用结合上生物素,并且不改变其生物活性,这使得生物素和亲和素在亲和层析分离中有更广泛的用途。

3.维生素、激素和结合转运蛋白

通常结合蛋白含量很低,如1000升人血浆中只含有20毫克Vit -7-10-B12结合蛋白,用通常的层析技术难于分离。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力(解离常数为10 16M)而进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。由于亲和力较强,所以洗脱时可能需要较强烈的条件,另外可以加入适量的配体进行特异性洗脱。

4.激素和受体蛋白

激素的受体蛋白属于膜蛋白,利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质,难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力(10 6-10? 12M)而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白,如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。

5.凝集素和糖蛋白

-D-甲基葡萄糖苷洗脱。同样,用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配体也可以分离各种凝集素。a-D-甲基甘露糖苷或a-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白,麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合,可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物,就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。

如洗脱伴刀豆球蛋白A吸附的蛋白可以用a-D-吡喃甘露糖苷或a凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白,几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖,因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。

6.辅酶

核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子,利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶,包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛,可以用于分离各种激酶和脱氢酶。

7.多核苷酸和核酸

利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离各种RNA、RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。

8.氨基酸

固定化氨基酸是多用途的介质,通过氨基酸与其互补蛋白间的亲和力,或者通过氨基酸的疏水性等性质,可以用于多种蛋白质、酶的分离纯化。例如L-精氨酸可以用于分离羧肽酶,L-赖氨酸则广泛的应用于分离各种rRNA。

9.染料配体

结合在蓝色葡聚糖中的蓝色染料Cibacron Blue F3GA是一种多芳香环的磺化物。由于它具有与NAD+相似的空间结构,所以它与各种激酶、脱氢酶、血清清蛋白、DNA聚合酶等具有亲和力,可以用于亲和层析分离。另外较常用的还有Procion Red HE3B等。染料作为配体吸附容量高、可以多次重复使用。但它有一定的阳离子交换作用,使用时应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附。

10.分离病毒、细胞

利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用,亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞,胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。由于细胞体积大、非特异性吸附强,所以亲和层析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基质如Pharmacia公司生产的Sepharose 6MB,颗粒大、非特异性吸附小,适合用于细胞亲和层析。

11.金属螯合色谱

金属螯合色谱以及后面介绍的共价色谱、疏水色谱是一些特殊的亲和层析技术。金属螯合色谱通常使用亚氨二乙酸(IDA)等螯合剂,它能与Cu2+、Zn2+、Fe2+等作用,生成带有多个配位基的金属螯合物,可以用于生物分子尤其是对重金属有较强亲和力的蛋白质的分离纯化。例如Cu2+-IDA配体可以用于分离带精氨酸的蛋白质。

12.共价色谱

共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将其吸附,而后用适当的处理方法将共价键打开而将蛋白释放出来。例如活化的巯基-Sepharose、巯丙基-Sepharose等活化基质可以直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价结合而将其吸附在基质上,通过适当的洗脱液如半胱氨酸,巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱下来。共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和,可以多次重复使用。

层析技术的用途及特点是

叶绿体色素的提取和分离(纸层析法)原理叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用丙酮提取。 分离色素的方法有多种，纸层析是其中最简便的一种。当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合物中各成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的混合物得到分离。仪器药品大试管 台天平 研钵 量筒 烧杯 漏斗 软木塞 新华滤纸 丙酮 四氯化碳 无水硫酸钠 碳酸钙 石英砂操作步骤1.称取新鲜叶子2g，放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加丙酮5ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。 2.取准备好的滤纸条(2×20cm)，将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条，如图7。 3.用毛细管取叶绿素溶液点于窄条的上方，注意一次所点溶液不可过多，如色素过淡，用电吹风吹干后再点1梍2次。 4.在大试管中加入四氯化碳3梍5ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中(色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁)，盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。经过0.5-1小时后，观察分离后色素带的分布。最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。

层析技术主要用来

该技术结合了高空间分辨率和高化学灵敏度。 空间分辨率的深度为0.3nm，横向为0.5nm。 大多数元素的化学敏感度为几十ppm。

APT需要将样品制备成针状，其顶端半径为50-100 nm。 低温冷却针样品（25-100K）用DC电压（2-15 kV）偏置。在针尖处产生的静电场（几十V / nm）与脉冲激光或脉冲电压相结合，触发一个或多个原子从顶点表面蒸发。使用位置敏感探测器（PSD）记录每个探测到的离子的位置，同时基于飞行时间计算化学特性。