T4连接酶作用机制(t4连接酶连接体系比例)
t4连接酶连接体系比例
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上切口酶，借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。
T4连接酶效率
1、外形结构不同
T2噬菌体具有蝌蚪状外形，头部呈正20面体，外壳由蛋白质构成，头部包裹DNA作为遗传物质。是遗传物质比较特殊的一种病毒。
T4噬菌体具有典型的蝌蚪状外形，头部呈现六角形，尾部较长，可伸缩。头部的蛋白质外壳内含有折叠的DNA分子；尾部的蛋白质外壳为一中空的长管，外面包有可收缩的尾鞘。头部大小为65*95纳米（nm)，颈部长95nm，尾部120纳米。
2、组成不同
T2噬菌体仅蛋白质分子中含有硫，磷几乎都存在于DNA分子中，其化学组成中60%是蛋白质，40%是DNA。
而T4噬菌体的蛋白质含量多于T2噬菌体，约占 76%～81%。
3、特征不同
T2噬菌体与T4噬菌体在寄主细胞表面有不同的吸附位点：T4在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)B菌株上的吸附位点是LPS核心多糖中的α-葡糖基-(1→3)葡萄糖末端，在K菌株上则为LPS或外膜蛋白 OmpC，而T2噬菌体的吸附位点与之不同。
T4噬菌体中还存在一种酶，称为T4 DNA连接酶，在转基因技术中用作黏性末端和平末端的连接酶。对平末端连接效率低下。
t4连接酶的活性特点
1、承担药物活性检测平台建设；
2、收集和整理相关实验技术资料，提出研发方案；
3、承担体外细胞模型的建立、细胞活性检测和药物作用机制研究、药物药效学的评价、推进创新药研发项目；
4、完成实验报告及ELN的正确书写、协助实验和仪器SOP的建立和验证；
5、参与并负责蛋白组T4连接酶和其它工具酶或蛋白的表达、纯化；
6、及时完成实验记录和实验报告；
7、负责各种微生物的功能研究和记录；
8、负责各微生物分离、提纯及扩培试验方案的制定以及试验实施；
9、针对Assay和DNA编码化合物库对靶标蛋白的亲和筛选项目的需求，完成特定项目的方案完善；
10、按要求完成项目报告、SOP、专利及论文等科学文档的撰写及汇报；
11、予他人在实验技能与专业知识上的指导培训；
12、配合QA/QC工作等。
t4连接酶连接体系摩尔比
T4DNA连接酶用于平末端和黏性末端的连接
DNA连接酶 用于黏性末端的连接，这两种酶都是在基因工程构建基因表达载体时可能会用的酶。
RNA聚合酶 是转录时用的酶，哪里有转录哪里就需要
DNA聚合酶 是DNA复制时用的酶，可把单个脱氧核苷酸连接成长链。
而DNA连接酶连接的是DNA片段。
T4连接酶连接体系
首先是T,A连接,就是现在通常使用的T载体,一般的PCR产物都在两端加个A,这样T,A相配,T4连接酶可以把他们连在一起.第二,粘性酶切位点连接,把载体和外源基因用相同的酶进行酶切（双酶切,或者单酶切都可以）回收相应的片段,用酶切出来的粘性末端进行配对,T4连接酶进行连接.第三,平末端连接,也是用酶切,平末端也可以用T4连接酶连接,不过连接效率低的很.第四,同源重组,用一个含有目的基因的载体A和另外一个载体B共转染（转化）宿主,可以通过同源重组产生包含目的基因的B载体.多用在病毒载体和重组病毒的构建上.
T4连接酶
T4噬菌体是属于大肠杆菌T系噬菌体，为烈性噬菌体 。头部为二十面体对称，尾部为螺旋对称，称为蝌蚪形噬菌体。头部大小为80nm×110nm，内部含有双链、线状DNA分子，相对分子质量为1.12 x 108；尾部由尾领、尾鞘、尾髓、尾板、尾刺和尾丝组成，长短为110nm×20nm，尾丝可伸展，幅度可达140nm。
头部外壳含8种蛋白质，呈椭圆形二十面体，尾部含2种蛋白质，呈棒状。T4噬菌体DNA连接酶，最初来自受T4噬菌体侵染的大肠杆菌细胞，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平齐末端。
t4连接酶反应条件
1、 连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多 用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L， 作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是 连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。 2、 pH的影响：一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。 3、 ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol /L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L 时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于 -20℃保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长 期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。 4、 连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经 过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃ 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃ 60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。 5、 酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。进行黏末端连接时需先行稀释，稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。 6、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物， DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。要求线性化的连接产物， DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓 度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。