t4dna连接酶作用条件(t4dna连接酶作用原理)

t4dna连接酶作用原理

在基因克隆实验中具有重要作用。 DNA连接酶 - 几种酶的比较 限制性核酸内切酶(以下简称限制酶):限制酶主要存在于微生物(细菌、霉菌等)中。

它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

T4DNA连接酶作用原理

1、形成方式不同

DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。

DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键。dna聚合酶起到催化剂的作用，催化原来的dna进行复制，然后将原来的dna和复制以后的dna进行模板配对后，连接聚合在一起，就可以形成新的dna链。

2、模板不同

DNA连接酶不需要模板，因为DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。用DNA连接酶连接具互补粘性末端的DNA片段或是用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来。

DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链。DNA聚合酶的结构是三磷酸腺苷。

3、用途不同

DNA连接酶主要用于基因工程，将由限制性核酸内切酶“剪”出的粘性末端重新组合，故也称“基因针线”。如基因工程中，大肠杆菌连接酶连接黏性末端，T4连接酶既可连接黏性末端，又可连接平末端。

DNA聚合酶在DNA复制中起做用，主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。

t4dna连接酶反应温度

T4 PNK 可以使用T4 DNA 连接酶的bufferT4 PNK本身也需要ATP(或其他三磷酸的如TTP等)，T4 PNK的buffer中不含有ATP，主要是因为T4 PNK常用作放射性标记，所以一般使用的时候会添加放射性的ATP等，buffer中就不加入ATP了，以免影响标记率。T4 PNK的说明书中(NEB的)明确说明了，如果后续反应是连接反应的话，可以直接在T4 DNA连接酶的buffer中进行T4 PNK的反应。

t4dna连接酶的作用机理

DNA连接酶分为两类：常用的E·coliDNA连接酶（大肠杆菌中分离）和T4DNA 连接酶（T4噬菌体中分离的）

T4DNA链接酶

T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。

同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。

T4DNA连接酶适用的对象

T4噬菌体被证明是一个解决基因和信息传递本质的理想体系，是生命科学研究的一种模式生物。

T4 DNA连接酶

科学家们在T4噬菌体中发现了一种酶，称为T4 DNA连接酶。T4 DNA连接酶这种连接酶是由噬菌体T4基因编码的，感染大肠杆菌后，在宿主细胞中产生。其相对分子质量为6800，既可催化DNA黏性末端连接，也可催化平末端连接。T4 DNA连接酶在基因工程操作中被广在基因工程操作中被广泛应用

t4dna聚合酶作用原理

Klenow 酶是 1974 年 Klenow 用枯草杆菌蛋白酶水解 DNA 聚合酶 I， 得到两个片段， 其中大片段的分子量为 75kDa， 它具有 5' -3' 聚合酶和 3' -5' 外切核酸酶的活性， 小片段具有 5' -3' 外切核酸酶活性。 由于大片段失去了 DNA 聚合酶 I 中会降解 5' 引物的 5' -3' 外切核酸酶的活性， 所以在基因工程中更有用。 　　Klenow 酶主要有下列用途： 　　(1) 修复反应， 制备平末端 可用 Klenow 酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的 5' 或 3' 突出末端， 制备平末端， 这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA 片段通过平末端重组。 如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸， 用这种末端填补的方法可以制备 3' 末端标记的探针。 用 Klenow 酶修复 5' 突出末端的反应主要是利用了 Klenow 酶的 DNA 聚合酶活性， 是填补反应； 而修复 3' 突出末端则是用 Klenow 酶的3' -5' 外切核酸酶的活性， 是切割反应。 用 Klenow 酶的切割反应来修复 3' 突出末端是不理想的， 改用 T4DNA 聚合酶或其他的酶是更好的选择。 　　(2) 标记 DNA3' 突出末端(protruding end) 该反应分两步进行： 先用 3' -5' 的外切核酸酶活性除去 3' 突出末端， 产生 3' 隐含末端， 然后在高浓度的标记底物( -32p-dNTP) 存在下， 使降解(3' -5' ) 作用与聚合(5' -3' ) 作用达到平衡。 这种反应也叫交换或取代反应(exchange／ replacement reaction) 。 不过这一反应用 T4DNA 聚合酶的效果更好， 因它的 3' -5' 外切核酸酶活性较强。 　　(3) 其他的一些用途： 包括用双脱氧末端终止法进行 DNA 序列分析、 用于 cDNA 第二链的合成、 在定点突变中用于合成第二链、 用引物延伸法(primer extension) 制备单链 DNA 探针等。

t4连接酶的原理

推荐在10~20μl反应体系中进行接反应，反应中DNA浓度最大可达1mM（1kbDNA约1mg/ml）。

首先混合要接的DNA片段，加入10× Ligase Buffer至终浓度为1×，再加入适量T4 DNA Ligase混匀。最适连接温度为16℃。粘末端连接效率较高，加入0.2~1μl T4 DNA Ligase,可在室温或16℃反应1~3小时完成反应；平末端连接效率较低，加入1μl T4 DNA Ligase，通常需要在16℃或4℃过夜完成反应。

t4dna连接酶特点

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上切口酶，借助ATP或NADP水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。

但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。

重组酶与T4DNA连接酶的区别

基本步骤

1 目的基因的获得

方法有：基因文库（cDNA文库、基因组文库）、PCR（放达效应）、人工合成

2 目的基因与载体连接

方法有：

——粘性末端——全同源性、定向克隆（两种酶切）

定向克隆可防止高背景的产生，因为全同源性会造成载体自连、重组子、目的基因自连三种可能，重组子可能还会出现正反插入的情况，使筛选过程复杂。

——平末端

酶切后也有可能产生平末端，也会出现高背景。

——人工接头——连接子（连入带粘性酶切位点的片断，再酶切）、普适子（一条链连上片断，成为粘性末端）、T-A克隆（PCR中使用的Taq聚合酶会根据模板延伸至后在链末尾加上一个A，可在克隆载体上加上T，使之连接）、同聚物加尾（末端转移酶加尾）

由于平末端连接效率比较低，可在其两端人工修饰

反应体系：目的基因、载体、T4连接酶、缓冲液

3 重组DNA导入受体（宿主）细胞——转化、转染、转导、感染

主要运用的是原核转化（导入感受态细菌，感受态：处于易于吸收外缘DNA的状态，方法：氯化钙法：DNA与其形成羟基-磷酸钙复合物，抗DNase水解）、真核转染。

4 筛选与鉴定

方法：

——遗传学（表形）——插入失活、蓝-白筛选、抗性基因（四环素Tet、氨苄青霉素Amp）

——酶切，在电泳（分子量、构想）

——PCR（特异性引物）

——核酸杂交（southern blot）

——免疫学方法（western blot）

——DNA测序（sanger、焦磷酸测序）

t4dna连接酶催化的连接反应需要能量

T4 DNA聚合酶由于同时具有5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'DNA外切酶活性，可以用于将5'端突出末端补平或3'端突出末端削平。T4 DNA聚合酶的3'→5'DNA外切酶活性对于单链DNA要比双链DNA活性更高，即单链DNA要比双链DNA中的非配对链部分更容易被T4 DNA聚合酶所消化。T4 DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍。产品用途：T4 DNA Polymerase可用于催化以下反应：DNA 5'或3'突出末端的平滑化；通过置换反应进行标记DNA探针合成；定点突变过程中第二链的合成；不依赖于连接反应的PCR产物克隆。