pcr扩增聚合酶作用(pcr扩增聚合酶作用是什么)

pcr扩增聚合酶作用是什么

1、DND聚合酶——又称DNA依赖的DNA聚合酶

它是以DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。DNA聚合酶根据聚合酶活力特征和外切酶活性特征的不同，有可以分为多种。在IVD领域中比较常见的酶如下：

Taq DNA聚合酶——Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，从Thermus aquaticus中分离出来，是目前科研和分子诊断试剂盒里最为广泛应用的聚合酶。为了更优化PCR反应体系，Taq DNA 聚合酶被进行了一系列的性能提升和优化，其中最为熟知的就是热启动Taq酶.

热启动Taq酶：该酶被进行了化学修饰、抗体修饰或者配体修饰。无论是哪种修饰，其原理都是：在反应体系加热至高温之前，Taq DNA 聚合酶活性被“修饰”抑制，进而抑制低温条件下的非特异性扩增。另外，还有一系列突变体Taq DNA聚合酶被筛选出来以满足耐镁离子、耐盐、高保真等要求。

Bst链置换DNA聚合酶——Bst DNA聚合酶是来源于 Bacillus stearothermophilus的DNAPolymerase I，经基因工程改造去除了其 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。同时，该酶在扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等方面均有大幅提高，而且增加了dUTP耐受性，非常适合于防污染的等温扩增反应，如 LAMP 等。

由于此次新冠的影响，Bst成为IVD领域内又一个DNA聚合酶宠儿。

除了Bst外，还有其他类似功能的链置换DNA聚合酶，如如Bca best聚合酶、 Klenow聚合酶、phi29DNA聚合酶等。

Tth DNA聚合酶——Tth DNA聚合酶来自Thermus thermophilus HB8，其最有趣的现象是：在Mg2+条件下，Tth DNA聚合酶具有较强的DNA聚合酶活性。在Mn2+条件下，Tth DNA聚合酶具有更强的反转录活性。这一特性使得Tth DNA聚合酶搭配相应的buffer可以同时对DNA模板和RNA模板进行扩增。

2、逆转录酶——又称为RNA依赖的DNA 聚合酶

该酶以RNA为模板，按5'-3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA (complementary DNA，CDNA)。最常用的逆转录酶为M-MLV和AMV。

3、RNA聚合酶——一条DNA链或RNA为模板的聚合酶

也称为转录酶。最为常见的是T7 RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。目前体外诊断中，SAT技术中会看到RNA 聚合酶的身影。如仁度、中帜的RNA扩增方法中就需要使用RNA聚合酶。

4、蛋白酶K——能够酶解样本中的各类蛋白质的酶

蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，在较广的pH范围（4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)下均有活性，EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。用于质粒或基因组DNA、RNA的分离和抽提。在病毒核酸检测中，蛋白酶K是病毒采样液中的重要组分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，同时将病毒基因组释放以便后续进行核酸抽提。

5、UDG酶——高效控制PCR残余污染

尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），这种酶也称为尿嘧啶 -N- 糖基化酶或UNG酶。

因PCR是一种极敏感的扩增技术，易受污染的影响。小量的外源 DNA 污染可以与目的模板一块被扩增。卫生部明确规定，凡是用于临床检验的PCR试剂，都应该有UNG酶技术，以防止污染。由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。

UDG酶的作用原理：在PCR产物或引物中用dU代替dT或者。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。

热敏性UDG: 除了常规UDG外，现在也开发出热敏型UDG，热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白，又称南极热敏UDG，热敏型UDG在50℃ 5min即完全失活。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。

6、限制性核酸内切酶——识别并剪切特定的脱氧核苷酸序列

限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。

常用的酶，如BsoB I, Hinc II，Nt.BstNBI切刻内切酶。其中，BD公司的链置换扩增术(stranddisplacement amplification,SDA)等温PCR系统中选择的酶需具有切割位点专一性，且对识别位点的化学修饰敏感。新冠疫情中Abbott 的明星产品ID NOW等温PCR系统中，就采用Nt.BstNBI内切酶。

7、解旋酶，helicase——使双链DNA变成单链DNA

利用ATP水解提供的能量来解开双链DNA核苷酸配对形成的氢键，从而形成单链DNA；

常用解旋酶：大肠杆菌的UvrD和T7噬菌体的gp4；大肠杆菌解旋酶II（UvrD），其解链速度是20bp/s，对反应速度有很大的制约性。T7噬菌体的解旋酶gp4解旋酶的解链速度更快，可达400bp/s，可以大大提高反应速度。

目前，Quidel等温PCR系统HAD中采用此酶

pcr扩增的作用

pcr中引物的作用是作为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，在细胞外的条件下，只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。

pcr扩增的酶

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

pcr反应中用于扩增dna的酶是

模板，为PCR扩增提供DNA序列；dNTA，合成的原料；聚合酶，聚合反应的实施者；反应buffer，为酶提供的条件；引物，指导PCR反应的方向。

pcr为什么叫多聚酶链式反应

合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction）(又称：多聚酶链式反应)PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

pcr扩增使用的dna聚合酶特点

ARMS-PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。

常规PCR扩增DNA所用的上、下游引物与靶序列完全匹配，而等位基因PCR采用等位基因特异的两条上游引物，两者在3’端核苷酸不同，一个对野生型等位基因特异，另一个对突变型等位基因特异，在Taq DNA聚合酶作用下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物，而与模板匹配的引物体系则可扩增出产物，通过凝胶电泳或者qPCR就能很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定SNP基因型，目前市场主流为ARMS+qPCR技术，采用TaqMan探针进行检测。

（比如肿瘤靶向用药EGFR基因检测，CFDA批准的检测试剂盒，90%以上都是ARMS检测方法）

pcr中聚合酶的作用

　　在PCR技术中，引物的作用是为了使脱氧核苷酸加到模板链上，使新链延长，没有引物，DNA聚合酶是不能将单个的脱氧核苷酸加到模板链上的。　　而TaqDNA聚合酶是一种耐高温的DNA聚合酶，是从美国黄石国家公园的一个热泉中的一种耐热细菌中提取的，它的作用就是将脱氧核苷酸加到模板上后，将该脱氧核苷酸与原来的脱氧核苷酸间的磷酸二酯键连在一起，使脱氧核苷酸单链向前延伸，最终形成一个新的双链DNA分子。

pcr扩增的酶是什么

　　Mighty AMP 　　追求极高反应性能开发的PCR酶，由于本酶具有很强的扩增性能，对于使用普通PCR酶难以扩增的、如含有大量PCR阻害物的生体粗提样品也显示出很好的扩增能力

PCR扩增反应

PCR 反应指的是主要由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA 聚合酶、靶序列DNA 和PCR 反应缓冲液体系组成的反应。

设计PCR 反应时要做到以下几个方面：

(1)引物长度- 一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。

(2) 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。

(3) G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。

(4) 要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。

pcr扩增技术延伸需要什么酶

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

DNA的复制需要RNA引物，这是由DNA聚合酶和RNA聚合酶的特性决定的。DNA聚合酶不能从头合成DNA（需要引物DNA or RNA），因为DNA聚合酶具有高保真系统，这个系统要求，在新链的延伸过程中，只有新添加的碱基与模板链形成双螺旋才能继续链的延伸，否则延伸终止，启动切除修复机制，直至添加正确的碱基，也即是在DNA聚合酶的上游位置一定要互补形成双链（可以是RNA-DNA）才能继续下游DNA的合成，这是它的忠实性和高保真系统决定的