pcr各试剂缓冲液作用(pcr缓冲液的作用)

pcr缓冲液的作用

PCR实验室中缓冲间的功能是“控制空气的流向”。

实验室建立要注意以下，

1. 要有紧连PCR实验室的高压灭菌锅。

2. PCR实验室内每个房间的所有进、出风口均需加装高效过滤器。

3. 标本处理间必须配备A2生物安全柜和通风橱并有外连，外连出口需加高效过滤膜。

4. PCR实验室的压力梯度，从高到低单一流向：试剂制备区--标本制备区--扩增区--产物分析区，建议调整为：试剂制备区+10pa＞标本制备区0pa＞扩增区—10pa＞产物分析区—15pa～—20pa。缓冲间压力梯度为 试剂制备区—10pa、标本制备区—10pa、扩增区—5pa、产物分析区—10pa。

pcr缓冲液是什么

包含PCR 反应缓冲液、SYBR GreenⅠ染料、ROX、dNTPs、Mg2+ AmpErase UNG及GeneCore Taq Gold HS DNA Polymaras的2×混合液

PCR缓冲液的作用

PCR反应体系由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成。

设计PCR引物时的一般原则：

(1)引物长度一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。

(2) 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。

(3) G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。

(4) 要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。

(5) 引物3' 端碱基一般应与模板严格配对，并且3' 端为G、C 或T 时引发效率较高。

pcr缓冲液的作用原理

上样缓冲液中甘油与溴酚蓝的左右分别是① 上样缓冲液中包括甘油,溴酚蓝,SDS等,甘油主要作用是防止样品漂浮出点样孔,溴酚蓝作为电泳指示剂,用来观察电泳进度,SDS用于一些核酸结合蛋白的变性解离.②核酸染料与凝胶中核酸结合,以便于在紫外光下显示核酸条带.

pcr反应液缓冲液

PCR反应循环参数是指在聚合酶链式反应中，循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR的扩增效果，而反应体积、循环次数对其扩增效果影响较小。

多重PCR(mutiplex PCR)技术因具有高效、高产率、能降低实验成本、加速实验进程等优点，要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增, 因而影响其扩增效果的因素较多, 主要有循环参数、反应体积、反应体系、引物间的碱基配对等。

pcr缓冲液的作用是什么

pcr需要的原料有:物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液。 PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)

pcr缓冲溶液的主要作用

PCR反应需要加镁离子，并且镁离子浓度的总量应该比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L。 镁离子是加在PCR反应的缓冲液中的，成分是最复杂的，除水外一般包括四个有效成分：

1、缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；

2、一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；

3、二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；

4、辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。 缓冲液的目的是提供合适的酸碱度与某些离子，而PCR反应五要素是：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

pcr中缓冲液的作用

PCR反应体系：

1. 缓冲液

标准的缓冲液含 1pmol/ml Tris ·HCl，其 pH 为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+。

2.dNTP

脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在内的统称，即合成新的 DNA 链的材料。4 种 dNTP 的浓度相等，总浓度一般为 200pmol/ml （即饱和浓度）。dNTP 可与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度下降，影响 DNA 聚合酶的活性。

3. 引物

引物是一段短的单链 DNA 片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA 聚合酶可由其 3′端开始合成新的核酸链。引物长度一般以 18～30bp 为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。

4. 模板

模板是一段单链或者双链 DNA，提供用于进行 PCR 扩增的原始信息。对模板的纯度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白等。模板 DNA 应该尽量保持低温保存。

5.Taq DNA 聚合酶

Taq DNA 聚合酶以 DNA 为复制模板，从将 DNA 由 5' 端点开始复制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、dNTP 等的情况下）及其相辅的活性。必须一直保存于－20℃，内含甘油保存。最适反应温度 72 ℃，即延伸温度。通常在配制 PCR 体系的最后加入。

pcr缓冲间的作用

从原理上讲，所有防止污染源的房间均应设置为正压，以避免外部污染源的入侵。比如常规的无菌检测室、超净工作台等遵循的就是正压原则；所有产生污染源的房间均应设置为负压，以防止内部污染源的扩散，如特殊的生物安全实验室、PCR扩增室等都应设置为负压。通风柜和生物安全柜遵循的就是负压原则。

核酸扩增和产物分析主操作间和缓冲间设置为负压，以防止扩增与电泳操作过程中产生的气溶胶会在开门过程中扩散到走廊，进而扩散到试剂准备室和样品处理室而导致结果的假阳性。

pcr反应常用的缓冲体系是什么

PCR反应中缓冲液是一个重要的影响因素，特别是其中的Mg2+能影响反应的特异性和扩增片段的产率。目前最为常用的缓冲体系为l0～50mmol／L的Tris—HCl(pH8．2～8．3，20℃)，PCR标准缓冲液含有10mmol／L的Tris—HCl(pH8．3)、50mmol／L的KCl、1．5mmol／L的Mg2+、0.1g／L的明胶。在一般的PCR反应中，1．5～2．0μmol／L Mg2+是比较合适的(对应dNTP浓度为200μmol／L左右)。Mg2+过量能增加非特异扩增并影响产率。

现在认为限制KCl和明胶的用量值得提倡，尤其是BSA，虽其对酶有一定保护性，如果质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。KCl在50mmol／L时能促进引物退火，大于此浓度时将会抑制聚合酶的活性。有的反应液以氯化铵或醋酸铵中的NH+才代替K+，其浓度为16．6mmol／L。

在PCR中使用10～50mmol／L Tris HCl，主要靠其调节pH使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。Tris缓冲液是一种双极化离子缓冲液，pKa为8．3(20℃)，△pKa为一0.021／℃。

在反应体系中加入适量(10％)的二甲基亚砜(DMSO)，虽然DMSO对聚合酶活性有一定抑制作用，但它可减少模板二级结构，提高PCR反应特异性。有报道指出甲酰胺或氯化四甲基铵(TMAC)均可提高反应特异性，而对酶活性没有明显影响。

PCR标准缓冲液对大多数模板DNA及引物都是适用的，但对某一特定模板和引物的组合，标准缓冲液并不一定就是最佳条件，因此各实验室可在此条件上，根据具体扩增项目进行改进。其中Mg2+浓度对扩增作用的特异性和产量有明显影响。Taq酶是一种Mg2+依赖酶，Mg2+浓度一般为1．5mmol／L左右，Mg2+浓度过低时，酶活力明显降低；过高时，酶可催化非特异性扩增。由于反应体系中的DNA模板、引物和dNTP都可能与Mg2+结合，因此降低了Mg2+的实际浓度。所以建议反应中Mg2+用量至少要比dNTP浓度高O．5～1．0mmol／L。