pcr中各种试剂的作用(pcr反应试剂及其作用)
pcr反应试剂及其作用
pcr反应的保真性一般由taq酶和反应的循环数决定。
一般在pcr反应中包括定性，定量，和pcr产物后续的亚克隆实验。一般定性和定量实验对保真性的要求不高，但是如果pcr产物需要进行后续的亚克隆实验，就需要确保产物的保真性。目前很多试剂厂家都会生产不同保真性的taq酶，由于pcr反应过程中是碱基在酶的作用下延伸，所以总会有几率出错，目前很多高保真性的酶可以在出错的情况下将错误碱基删除以确保保真性。循环数对保真性也有一定的影响，一般在28个循环以内，以保证保真性。
pcr用到的试剂
PCR试剂简单的理解就是用于做PCR的试剂。实际做PCR的试剂很多，在这儿可以理解为达到PCR级别的试剂。试剂中不应该存在对PCR反应有影响的杂质。象核酸、核酸酶，如果是水的话，盐离子尽可能的小，最好是超纯水。象一些盐类，分析纯的就可以达到要求。如果想做PCR，买点TAQ酶，dNTP就够了，引物找公司合成，模板自己提取。
pcr试剂的作用
为了更好的pcr效果可以进行优化操作。
现在基本上都用试剂盒，一般需要优化的主要是退火温度和模板浓度，而引物浓度、酶的用量、dNTPs基本都是标准用量。
退火温度优化可以采用梯度pcr技术，梯度pcr仪非常容易设定。模板浓度根据标准浓度做几个梯度即可。一般一轮梯度pcr下来基本就能找到优化pcr结果。
pcr反应试剂及其作用有哪些
PCR，中文名称为聚合酶链式反应。它的原理是一种体外酶促合成特异DNA片段。在进行PCR实验操作过程中，需要保持反应管试剂的低温。
通常的做法是将反应管至于碎冰上，需要使用制冰机进行制冰，这很不方便,且反应管不易固定，现有的冰盒制冷时间较短，且孔槽内部容易积累灰尘不易清理。
pcr体系中包含哪些试剂,各起什么作用
2xBIOGHSC Super MultiProbe Mix 10μl
BIOGHSC Super Enzyme Mix 0.5μl
RT-PCR Enhancer 0.25ul
上下游引物 (10μM) 各0.6μl
TaqMan Probe (10μM) 0.5μl
模板RNA 10ng-1μg
RNase free ddH2O 加至20µl
简述pcr技术的原理及各试剂的作用
PCR检测试剂就是PCR的反应体系，经典PCR以DNA为模板，其体系组成以下几方面:1.原始模板:微生物检验中将待测样本中的细菌或病毒DNA，作为扩增反应的原始模板；
2.引物:两段单链寡核苷酸，其序列与代扩增片段的两端分别相同和互补，作为DNA合成反应的引物；
3.原料:4种脱氧核苷酸三磷酸作为DNA合成的原料；
4.DNA聚合酶:催化DNA合成；
5.合适的盐、缓冲液以及温度循环参数。
pcr反应中各试剂的作用
LAMP 原理:
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerasc)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60rain左右即可核酸扩增，效率可达109~10m个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时， 从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs) 中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。
LAMP法的应用领域:
灵活运用能够简单、快速地进行基因扩增的特征,在各个领域得到广泛应用
食品领域:食物中毒致病菌的检测,食品的卫生管理,食物中毒的防止;
临床领域:病原菌、病毒的检测及鉴定,通过SNP多态性分型决定用药量;
农业领域:植物病害的早期发现及蔓延防止,转基因作物的检测;
环境领域:环境、水中病原微生物的检测;
工业领域:工业产品用大量DNA的生产成为可能;
畜牧业领域:雌雄性别判断,病原微生物的检测,遗传病的发现.
pcr反应的作用
PCR技术原理和操作
PCR技术是指，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
一、PCR技术的基本原理和操作
1、PCR反应的成分和作用
总体积：一般为25μl～100 μl
（一）Mg2+:终浓度为1。5～2。0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会YZTaq酶的活性。 Mg2+能影响反应的特异性和产率。
（二）无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会YZDNA聚合酶活性。
（三）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。
（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7。0～7。5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。
（五）Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其Z适pH值为8。3～8。5，Z适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0。5～5个单位/100μl。
（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有YZ作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶YZ剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。
（七）引物：引物浓度一般为0。1～0。5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基Z好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。
引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。
2、PCR反应步骤和反应条件选择（影响因素）
a、变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。
b、退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。
c、延伸：延伸温度应在Taq酶的Z适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加
pcr各试剂的作用
甘油能降低高G+C区域的二级结构，能促进长距离PCR和提高标准PCR方法的反应专一性。此外，有报导在多重PCR(O.Henegariu等，Biotechniques，1997，23504)和等位专一PCR(R.S.Cha等，PCR Methods and Applications，1992，214)反应液中添加甘油。上述研究有二个共同特点，
第一，甘油浓度较低通常为5-10％(V/V，下文中未指明的均指体积百分比)，文献报导的最高浓度为20％(Y.H.Liu等，Trends in Gentics，1993和S.Vilcek，Journal Virological Methods，1993，41245)
第二，添加甘油后变性温度包括首次和循环变性均仍采用常规的94或95℃。尚未有文献或专利将甘油浓度扩展至20-45％，并且将含5-45％甘油的PCR反应的首次变性温度提高到大于95℃至98℃，循环变性温度降低到小于94℃至60℃的报道。
在一管法RT-PC方面，至今仅有一篇文献(T.W.Myers等，PCR Strategies，p.58-68，Ed.M.A.Innis等，1995)在反应液中添加3％甘油，加上原来由DNA聚合酶和反转录酶试剂带进的2％甘油，使PCR能在含5％甘油反应液中进行。未有将一管法RT-PCR反应液的甘油浓度扩展至5-25％的报道。
pcr的试剂影响因素有哪些
PCR跑胶不亮说明PCR扩增效率低，需要找出原因并进行优化，获得高效扩增。
影响PCR扩增效率的因素很多，引物，模板，反应系统，聚合酶都有可能。目前一般实验室都采用PCR试剂盒，反应系统基本没有问题。
鉴于跑胶不亮判断是有扩增效率不高，因此可能是模板浓度过低或聚合酶活性偏低。建议提高模板浓度和酶的使用量。