胰凝乳蛋白酶的作用(胰凝乳蛋白酶的作用机制)

胰凝乳蛋白酶的作用机制

脲酶。1926年萨姆纳纯化出了高活性的结晶脲酶，并且证明这些晶体的主要成分就是蛋白质。

他推测其他的酶也是蛋白质，不过由于缺乏实证，当时人们对他的这个观点还颇有异议。

直到1930年代美国化学家诺思罗普结晶出胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等，并证明它们都是蛋白质之后，萨姆纳的结论才被广泛接受。

概述胰凝乳蛋白酶的作用机制

天然发酵

生产工艺流程：新鲜原料和盐混合(31或21)→前期发酵(自溶)→中期发酵→后期发酵(一周，保温40℃～50℃)→调配→过滤→检验→杀菌→包装→成品。天然发酵的鱼露风味独特，非常鲜美，但其生产周期较长，一般为数月甚至一年以上。为了获得更好的风味，有的甚至达到二到三年左右。

鱼露低盐发酵

天然发酵过程中，为了防止腐败微生物的繁殖，采用了高盐度盐渍的方法，高盐虽然抑制了腐败微生物的繁殖，却同时也抑制了蛋白酶的作用。设想能够创造蛋白酶作用的最适条件，同时抑制腐败微生物的繁殖，以期达到缩短发酵周期的目的。方法即采用低盐和高温的结合应用。低盐可以提高蛋白酶的作用，但低盐也能提高腐败微生物的腐败作用，为了抑制微生物的作用，可以采用高温。这样不仅可以抑制微生物的繁殖，还可以蛋白酶的作用，而且还能驱除发酵液中的臭味，提高鱼露质量。

2.鱼露内脏发酵

在鱼露的发酵过程中，加入适量的酶活鱼内脏，因其含有丰富的蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶等，可以加速蛋白质的分解，从而缩短发酵周期。

3.鱼露加曲发酵

在鱼露发酵过程中，加入一些酿造酱油所用的米曲霉或酿造清酒所用的曲种等，利用它们所分泌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，将原料鱼中的蛋白质、脂肪、碳水化合物等充分分解，经一系列的生化反应，形成鱼露特有的风味。还有一种方法是可以从传统鱼露的发酵过程中分离筛选出耐盐、嗜盐菌，把这些菌在合适的条件下扩大培养，再加入到盐渍的原料中去，能够加速蛋白质等的分解过程，而且其蛋白质分解度高，鱼露风味较好。

4.鱼露复合方法

鱼露快速发酵方法主要以复合方法为主，即以上三种方法的结合使用。如降低盐保温发酵与加曲发酵的结合，加酶及加曲的结合等。

胰凝乳蛋白酶催化反应机制

“胰”与人或高等动物体内的腺体有关。胰腺它有两个主要功能：有助于消化的外分泌功能和调节血糖的内分泌功能。胰腺含有外分泌腺，产生帮助消化酶。这些酶包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶易消化蛋白质;淀粉酶用于消化碳水化合物;和脂肪酶分解脂肪。

胰凝乳蛋白酶的作用机制是

胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin，bovine γ，PDB 1AB9，EC 3.4.21.1），也叫糜蛋白酶。

胰凝乳蛋白酶活性

酶原，即酶的前提，是一种没有生物催化活性的蛋白质，但是经过激活后就可以长生催化活性。

这种机制是生物为了保护自己而产生的。比如消化酶，生物细胞翻译出酶原没有消化能力，分泌出去到消化道后经过胰凝乳蛋白酶激活产生活性，催化消化。之所以一开始产生酶原是因为如果细胞直接翻译出有活性的消化酶，那么消化酶就会消化细胞自身，所以才先产生酶原，等到了消化位点再激活。

胰凝乳蛋白酶的作用机制举例

人体通过食物摄入的蛋白质，在胃肠道内，通过各种酶的联合作用，分解成氨基酸，再通过小肠进行吸收。

具体过程如下：

食物中的蛋白质经过口腔，进入食道和胃中。胃黏膜分泌胃泌素，从而刺激胃腔壁细胞分泌胃酸和胃蛋白酶原。胃蛋白酶将食物中的蛋白质分解成大小不等的多肽片段。随食糜进入小肠，小肠刺激胰分泌胰液，同时中和胃酸，使之PH值达到7.0左右。同时小肠上的十二指肠，释放出肠促胰酶肽，以刺激胰腺分泌胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶原等，从而转变成胰蛋白酶原，它能将肽片段进一步分解成更短小的肽最后分解成

氨基酸，再由肠黏膜上皮细胞吸收进入机体。

而氨基酸就可以参与人体的新陈代谢了

胰凝乳蛋白酶的作用机制是什么

无活性的酶原蛋白

酶原某些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原，使酶原转变为有活性酶的作用称为 酶原激活

比较著名的例子是消化酶的酶原（胃蛋白酶原， 胰蛋白酶原， 胰凝乳蛋白酶原）和血液凝固酶的酶原（ 凝血酶原， 纤溶酶原）。胃酸可以激活胃蛋白酶原。酶原可以贮存在其合成部位而没有引起细胞或组织自我消化（ 水解）的危险，待细胞需要时再被激活。·酶原之所以没活性是因为 活性中心未形成或未暴露。 一般通过对多肽链的剪切修饰而使酶的活性中心形成或暴露出来。

胰凝乳蛋白酶的作用机制生物化学

酶原的解释

词语解释：

生物体内能转变成酶的化学物质，例如能转变成凝血酶的凝血酶原。

引证解释：

⒈ 生物体内能转变成酶的化学物质，例如能转变成凝血酶的凝血酶原。

网络解释：

酶原

有些酶在细胞内合成或初级释放时只是酶的无活性前体，必须在一定的条件下，这些酶的前体水解开一个或几个特定的肽键，致使构象发生改变，表现出酶的活性。这种无活性酶的前体称作酶原。

某些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原（zymogen），使酶原转变为有活性酶的作用称为酶原激活（zymogen activation）。

比较著名的例子是消化酶的酶原（胃蛋白酶原，胰蛋白酶原，胰凝乳蛋白酶原）和血液凝固酶的酶原（凝血酶原，纤溶酶原）。胃酸可以激活胃蛋白酶原。酶原可以贮存在其合成部位而没有引起细胞或组织自我消化（水解）的危险，待细胞需要时再被激活。·酶原之所以没活性是因为活性中心未形成或未暴露。 一般通过对多肽链的剪切修饰而使酶的活性中心形成或暴露出来。

胰凝乳蛋白酶的作用机理

米氏方程

表示酶促反应起始速度的方程

米氏方程（Michaelis-Menten equation）表示一个酶促反应的起始速度与底物浓度关系的速度方程。

在酶促反应中，在低浓度底物情况下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）。当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡。

基本信息

中文名

米氏方程

外文名

The Michaelis Menten equation

类型

速度方程

米氏方程简介

，这个方程称为Michaelis-Menten方程，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的，其中 值称为米氏常数，是酶被底物饱和时的反应速度，为底物浓度。

由此可见 值的物理意义为反应速度达到 时的底物浓度（即），单位一般为，只由酶的性质决定，而与酶的浓度无关。可用 的值鉴别不同的酶。

当底物浓度非常大时，反应速度接近于一个恒定值。在曲线的这个区域，酶几乎被底物饱和，反应相对于底物S是个零级反应。就是说再增加底物对反应速度没有什么影响。

反应速度逐渐趋近的恒定值称为最大反应速度。对于给定酶量的 可以定义为处于饱和底物浓度的起始反应速度n。对于反应曲线的这个假一级反应区的速度方程可写成一种等价形式：

速度常数k等于催化常数，是ES转化为游离的E和产物的速度常数。饱和时，所有的E都是以ES存在。方程（3.2）中还有另一个简单的关系式：。从中得出：。的单位是。催化常数可以衡量一个酶促反应的快慢。

米氏常数 是酶促反应速度n为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。这可通过用[S]取代米氏方程中的 证明，通过计算可得。

方程推导

建立模型

1913年Michaelis L.和Menten M.根据中间复合体学说提出了单底物酶促反应的 快速平衡模型或 平衡态模型（equilibrium-state model），也称为 米-曼氏模型（Michaelis-Menten model）：

式中E是酶，S是底物，ES是中间复合体，P是产物，是ES的 解离[平衡]常数，即第一步的逆向反应中的速率常数 和正向速率常数 之比，是催化常数，即第二步中的向前速率常数。

模型假设

在建立模型和推导模型的速率方程时，他们实际上做了以下几点假设：

①为了简化起见，假设反应中只有一个中间复合体，反应的第一步 是可逆反应，并保持始终；

②反应的第二步 是限速步骤，这里是限速步骤，这里，也就是说ES分解生成P的速率不足以破坏E和ES之间的快速平衡；

③为了达到平衡，只用初始底物浓度 的很小一部分，因为一般情况下（初始酶浓度），因此在反映的初期，底物浓度[S]可以用 代替，或是把[S]看作；

④酶在反应中不被消耗，只是或以游离形式E存在或以结合形式ES存在，因此游离酶浓度[E]和中间复合体浓度[ES]只和等于初始酶浓度 或总酶浓度，即

，这就是所谓的 酶守恒公式（conservation equation of enzyme）；

⑤该模型没有考虑 这一逆反应，但显然 是一个不等于零的常数，要忽略这一步，必需使[P]接近于零，因此米-曼氏方程只适用于反应的初速率。

推导过程

根据平衡态模型S转变成P的总速率应由限速反应（模型中第二步）决定，因此产物生成速率

ES复合体的浓度[ES]在实验上不易测定，需要找出容易测定的其他参数（如某些常数和已知的 等）来代替它。为此利用第一步反应（快速平衡）中ES解离成E和S的解离常数

则

将酶守恒公式 代入上式得

经整理得

代入 得

这里 具有特殊的意义。当底物浓度[S]高至使所有酶分子都被饱和时，则，反应初速率 将达到最大值，用数学式可表示为

因此 也可写成

模型改进

平衡态模型中前两点假设不具有普遍性，特别是没有理由认为所有酶促反应的 都远小于。因此1925年Briggs G. E.和Haldane J. B. S.对该模型提出了修正，但仍保留米-曼氏假设的后三点。他们用稳态模型（steady-state model）或称 Briggs-Haldane氏模型：

代替了平衡态模型。对观测初速率（即产物P尚未生成或很少生成时）来说，式中仍可忽略不计。所谓稳态是指反应进行不成的一段时间内（顺便提及，几毫秒内，这段时间的状态称为 前稳态），系统中[ES]由零增加到一定值，在一定时间内虽然[S]和[P]在不断变化，ES复合体也在不断地生成和分解，但ES的生成速率 与分解速率 接近相等，[ES]基本保持不变。因此在稳态下ES形成的净速率，

因为 且

所以

整理得

这里，速率是常数之比 本身也是一个常数，并被定义为 米氏常数（Michaelis constant）， ：

将 代入，整理得：

根据稳态模型，S转变为P的速率决定于稳态浓度和限速的速率常数。因此

将 代入上式，得

或

根据两种模型推导出的速率方程形式上是一样的，两者不同的是 比 具有更大的普遍性。稳态下，当 时，则，因此可以把平衡态看成是稳态的一个特例。为了纪念Michaelis和Menten两人，人们把上述带三角符号的的方程都称为 米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation）。

参数意义

①当 时， 。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。

②当 时，。因此，Km可以反映酶与底物亲和力的大小，即值越小，则酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。

③ 可用于判断反应级数：当，反应为一级反应，即反应速度与底物浓度成正比；当，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；当时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应。

是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。

⑤ 可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物。

⑥ 可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。

⑦ 可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。

⑷ 和 的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Hanes作图法。

双倒数图

酶促反应中的 和 值有几种测量方法。固定反应中的酶浓度，然后分析几种不同底物浓度下的起始速度，就可获得 和 值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定 或 值是很困难的，因为曲线接近 时是个渐进过程。所以通常都是利用米氏方程的转换形式求出 和 值。常用的米氏方程转换形式是Lineweaver-Burk方程，也称为双倒数方程。

使作图，可以获得一条直线。从直线与x轴的截距可以得到的绝对值；而是直线与y轴的截距。双倒数作图直观、容易理解，为酶抑制研究提供了易于识别的图形。

缺点：底物浓度低时，坐标点集中于坐标左下方，使得误差增大，往往偏离直线，无法精确定出。

解决方法：底物浓度配成的浓度级差，而不是[S]的浓度极差，使点距离平均，再以最小二乘法线性回归分析。

其他影响因素

1、底物浓度对酶促反应速度的影响

当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，中间络合物的浓度不断增高。

当底物浓度较高时，液中的酶全部与底物结合成中间产物，虽增加底物浓度也不会有更多的中间产物生成。

2、温度对酶反应速度的影响

一方面是温度升高，酶促反应速度加快。另一方面，温度升高，酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下，反应速度最大。

3、pH值对酶反应速度的影响

酶促反应速度受介质pH的影响，一种酶在几种pH介质中测其活力，可看到在某一pH时酶促效率最高，这个pH称为该酶的最适pH。酶作用存在最适pH提示酶分子活性基团的电离状态、底物分子及辅酶与辅基的电离状态都与酶的催化作用相关，但酶的最适pH也不是酶的特征性常数，如缓冲液的种类与浓度，底物浓度等均可改变酶作用的最适pH。

4、激活剂对酶反应速度的影响

凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂。

(1)无机离子：金属离子、氢离子。

(2)中等大小的有机分子：某些还原剂、乙二胺四乙酸(EDTA)

5、抑制剂对酶作用的影响

使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活的物质，称为抑制剂。

(1)不可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合(共价键)是不可逆反应，抑制剂与酶结合后不能用透析等方法除去抑制剂而恢复酶活性。如二异丙基氟磷酸对胰凝乳蛋白酶或乙酰胆碱酯酶；碘乙酸、碘乙酰胺、对一氯汞苯甲酸对巯基酶。

(2)可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合是可逆反应，用透析等方法能除去抑制剂使酶恢复活力。又可分为竞争性抑制作用和非竞争性抑制作用。

竞争性抑制作用是指有些抑制剂和底物结构极为相似，可和底物竞争与酶结合，当抑制剂与酶结合后，就妨碍了底物与酶的结合，减少了酶的作用机会，因而降低了酶的活力。它的特征是，当加大底物浓度时，底物和酶结合的几率增大，减少了抑制剂与酶的结合，抑制作用便会减弱。

非竞争性抑制作用是指有些抑制剂和底物可同时结合在酶的不同部位上，即抑制剂与酶结合后，不妨碍再与底物结合，但所形成的酶一底物一抑制剂三元复合物(ESI)不能发生反应。高浓度的底物不能使这种抑制作用逆转。