紫外法测vc含量中铜离子的作用原理(利用紫外吸收光谱检查物质的纯度)

利用紫外吸收光谱检查物质的纯度

分析对象：（１）有机化合物的定性分析，可以确定化合物的存在。（２）可以用来推断有机化合物的结构。（３）进行化合物纯度的检查。 （４）进行有机化合物、配合物或部分无机化合物的定量测定。

利用紫外吸收光谱检查物质的纯度数据处理

　许多有机化合物在紫外区具有特征的吸收光谱，因此可用紫外分光光度法对有机物质进行定性鉴定，结构分析及定量测定．紫外分光光度法定量测定的依据是比耳定律。

利用紫外吸收光谱检查物质的纯度注意事项

【目的要求】：

了解：分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理；

掌握：分光光度法测定DNA浓度和纯度的技术方法；

熟悉：分光光度法测定DNA浓度和纯度的实验操作步骤和注意事项。【实验原理】：

前面提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的，在后续的DNA酶切、连接及转化等实验中需要一定的浓度和纯度要求，因此要测定DNA的浓度和纯度。

测定DNA的方法通常有：紫外分光光度法；琼脂糖凝胶电泳法（也叫荧光光度法）

（1）紫外分光光度法：

组成DNA的碱基均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250～270nm之间，腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡聚核苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

分光光度法不但能够确定核酸的浓度，还可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。

（2）琼脂糖凝胶电泳法（荧光光度法）：

对于很稀的核酸溶液，可以用琼脂糖凝胶电泳法。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1g的DNA。该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度

利用紫外吸收光谱检查物质的纯度实验原理

紫外吸收光谱在分析上的应用：

（１）紫外光谱可以用于有机化合物的定性分析，通过测定物质的最大吸收波长和吸光系数，或者将未知化合物的紫外吸收光谱与标准谱图对照，可以确定化合物的存在。

（２）可以用来推断有机化合物的结构，例如确定1,2-二苯乙烯的顺反异构体。

（３）进行化合物纯度的检查，例如可利用甲醇溶液吸收光谱中在256nm处是否存在苯的B吸收带来确定是否含有微量杂质苯。

（４）进行有机化合物、配合物或部分无机化合物的定量测定，这是紫外吸收光谱的最重要的用途之一。其原理为利用物质的吸光度与浓度之间的线性关系来进行定量测定。

利用紫外吸收光谱检查物质的纯度vc实验报告

紫外吸收检测DNA浓度与纯度2007年11月13日 星期二 11:40目的： 了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。

原理： 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。

纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。

若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。

270nm存在高吸收表明有酚的干扰。

紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。

试剂与仪器： 提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。

操作步骤：1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。

2) 取质粒DNA样品2μl，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。

3) 在260nm和280nm分别读出样品光密度值。

如果样品浓度单位为μg/μl，则样品DNA浓度为OD 值的10倍，即如OD260=0.1，则样品浓度即为1μg/μl。

4) 若OD260/OD280大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。

利用紫外吸收光谱检查物质的纯度思考题

一、解释下列名词（每小题1分）二次代谢产物：苷化位移：HR-MS：有效成分：Klyne法：二、判断题（正确的在括号内划“√”，错的划“X”，每小题1分）（ ）1．13C-NMR全氢去偶谱中，化合物分子中有几个碳就出现几个峰。（ ）2．多羟基化合物与硼酸络合后，原来中性的可以变成酸性，因此可进行酸碱中和滴定。（ ）3．D-甘露糖苷，可以用1H-NMR中偶合常数的大小确定苷键构型。（ ）4．反相柱层析分离皂苷，以甲醇―水为洗脱剂时，甲醇的比例增大，洗脱能力增强。（ ）5．蒽醌类化合物的红外光谱中均有两个羰基吸收峰。（ ）6．挥发油系指能被水蒸气蒸馏出来，具有香味液体的总称。（ ）7．卓酚酮类成分的特点是属中性物、无酸碱性、不能与金属离子络合，多有毒性。（ ）8．判断一个化合物的纯度，一般可采用检查有无均匀一致的晶形，有无明确、尖锐的熔点及选择一种适当的展开系统，在TLC或PC上样品呈现单一斑点时，即可确认为单一化合物。（ ）9．有少数生物碱如麻黄碱与生物碱沉淀试剂不反应。（ ）10．三萜皂苷与甾醇形成的分子复合物不及甾体皂苷稳定。三．选择题（将正确答案的代号填在题中的括号内，每小题1分）1．（ ）化合物的生物合成途径为醋酸-丙二酸途径。A甾体皂苷 B三萜皂苷 C生物碱类 D蒽醌类2．能使β-葡萄糖苷键水解的酶是（ ）。A麦芽糖酶 B苦杏仁苷酶 C均可以 D均不可以3黄酮苷元糖苷化后，苷元的苷化位移规律是（ ）。A α-C向低场位移 B α-C向高场位移C邻位碳向高场位移 D对位碳向高场位移4．除去水提取液中的碱性成分和无机离子常用（ ）。A沉淀法 B透析法 C水蒸气蒸馏法 D离子交换树脂法5．中药的水提液中有效成分是亲水性物质，应选用的萃取溶剂是（ ）。A丙酮 B乙醇 C正丁醇 D氯仿6．用Hofmann降解反应鉴别生物碱基本母核时，要求结构中（ ）。A.α位有氢 B.β位有氢 C.α、β位均有氢 D.α、β位均无氢7．大多生物碱与生物碱沉淀试剂反应是在( )条件下进行的。A.酸性水溶液 B.碱性水溶液 C.中性水溶液 D.亲脂性有机溶剂8．合成青蒿素的衍生物，主要是解决了在（ ）中溶解度问题，使其发挥治疗作用。A.水和油 B.乙醇 C.乙醚 D.酸或碱9.具有溶血作用的甙类化合物为( )。A.蒽醌甙 B.黄酮甙 C.三萜皂甙 D.强心甙10.季铵型生物碱分离常用( )。A.水蒸汽蒸馏法 B.雷氏铵盐法 C.升华法 D.聚酰胺色谱法四、指出下列化合物结构类型的一、二级分类：五、用化学方法区别下列各组化合物：六、分析比较：（每个括号1分）1.比较下列化合物的酸性强弱：（ ）> ( ) > ( ) > ( ).并比较在硅胶板上展开后Rf值的大小顺序：（ ）> ( ) > ( ) > ( ).七、提取分离：（每小题5分）………………答案：一、二次代谢产物：由植物体产生的、对维持植物生命活动来说不起重要作用的化合物，如萜类、生物碱类化合物等。苷化位移：糖与苷元成苷后，苷元的和糖的端基碳的化学位移值均发生了变化，这种改变称为苷化位移：HR-MS: 高分辨质谱，可以预测分子量。有效成分：天然药物中具有临床疗效的活性成分。Klyne法：将苷和苷元的分子旋光差与组成该苷的糖的一对甲苷的分子旋光度进行比较，数值上接近的一个便是与之有相同苷键的一个。二、1（×）2（√）3（√）4（√）5（×）6（√）7（×）8（×）9（√）10（√）三、1 D 2 B 3 B 4 D 5 C 6 B 7 A 8 A 9 C 10 B四、1苯丙素，木脂素 2 黄酮 异黄酮 3 醌 菲醌 4 萜 单萜 5 生物碱 莨菪烷类五、1．异羟污酸铁反应 A(-) B (+) C (-); Edmeson反应 A (-) B (-) C (+)2．NaBH4反应 A (+) B (-) C (-); SrCl2反应 A (-) B (+) C (-)3．Legal反应 A (+) B (-) C (-); Keller-Kiliani反应 A (-) B (+) C (-)4．Shear试剂反应A (-) B (-) C (+); 异羟污酸铁反应A (+) B (-) C (-)5．Labat反应 A (-) B (+)六、1.B>A>D>C; C>D>A>B； 2.D>B>C>A; 3. C>A>B; 4. E>B>C>A>D七、1. A, C, B, E, D； 2. D, A, B, C, E