pcr常用试剂及作用(pcr体系中包含哪些试剂,各起什么作用)
pcr体系中包含哪些试剂,各起什么作用
PCR试剂简单的理解就是用于做PCR的试剂。实际做PCR的试剂很多，在这儿可以理解为达到PCR级别的试剂。试剂中不应该存在对PCR反应有影响的杂质。象核酸、核酸酶，如果是水的话，盐离子尽可能的小，最好是超纯水。象一些盐类，分析纯的就可以达到要求。如果想做PCR，买点TAQ酶，dNTP就够了，引物找公司合成，模板自己提取。
pcr体系中包含哪些试剂,各起什么作用的原因
目的在于克服现有技术存在的不足，而提供用于血液、口腔拭子进行PCR的裂解液及试剂盒，本发明试剂盒包含裂解液，全血、口腔拭子裂解后可直接进行PCR，大大优化现有的检测技术：为血液、口腔拭子提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法，省略核酸提取过程，简化了操作过程，节约了时间和成本，且能大量处理样本，操作检测时可防止污染。
pcr各种试剂的作用
随着分子生物技术发展和pcr技术的广泛应用，一些生物技术服务公司提供的产品与服务越来越简单高效和人性化。pcr试剂盒的mix体系就是其中一个，其中mix就是浓缩2～5x的最佳反应体系，其中包括浓缩的反应缓冲液，聚合酶，mg2+，dNTPS。客户仅仅需要加入模板，引物和补足水分就可以开始进行pcr。
pcr体系的作用
PCR反应体系由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成。
设计PCR引物时的一般原则：
(1)引物长度一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。
(2) 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。
(3) G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。
(4) 要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。
(5) 引物3' 端碱基一般应与模板严格配对，并且3' 端为G、C 或T 时引发效率较高。
pcr常用体系
1、DND聚合酶——又称DNA依赖的DNA聚合酶
它是以DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。DNA聚合酶根据聚合酶活力特征和外切酶活性特征的不同，有可以分为多种。在IVD领域中比较常见的酶如下：
Taq DNA聚合酶——Taq DNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，从Thermus aquaticus中分离出来，是目前科研和分子诊断试剂盒里最为广泛应用的聚合酶。为了更优化PCR反应体系，Taq DNA 聚合酶被进行了一系列的性能提升和优化，其中最为熟知的就是热启动Taq酶.
热启动Taq酶：该酶被进行了化学修饰、抗体修饰或者配体修饰。无论是哪种修饰，其原理都是：在反应体系加热至高温之前，Taq DNA 聚合酶活性被“修饰”抑制，进而抑制低温条件下的非特异性扩增。另外，还有一系列突变体Taq DNA聚合酶被筛选出来以满足耐镁离子、耐盐、高保真等要求。
Bst链置换DNA聚合酶——Bst DNA聚合酶是来源于 Bacillus stearothermophilus的DNAPolymerase I，经基因工程改造去除了其 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。同时，该酶在扩增速度、产量、耐盐性和热稳定性等方面均有大幅提高，而且增加了dUTP耐受性，非常适合于防污染的等温扩增反应，如 LAMP 等。
由于此次新冠的影响，Bst成为IVD领域内又一个DNA聚合酶宠儿。
除了Bst外，还有其他类似功能的链置换DNA聚合酶，如如Bca best聚合酶、 Klenow聚合酶、phi29DNA聚合酶等。
Tth DNA聚合酶——Tth DNA聚合酶来自Thermus thermophilus HB8，其最有趣的现象是：在Mg2+条件下，Tth DNA聚合酶具有较强的DNA聚合酶活性。在Mn2+条件下，Tth DNA聚合酶具有更强的反转录活性。这一特性使得Tth DNA聚合酶搭配相应的buffer可以同时对DNA模板和RNA模板进行扩增。
2、逆转录酶——又称为RNA依赖的DNA 聚合酶
该酶以RNA为模板，按5'-3'方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA (complementary DNA，CDNA)。最常用的逆转录酶为M-MLV和AMV。
3、RNA聚合酶——一条DNA链或RNA为模板的聚合酶
也称为转录酶。最为常见的是T7 RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。目前体外诊断中，SAT技术中会看到RNA 聚合酶的身影。如仁度、中帜的RNA扩增方法中就需要使用RNA聚合酶。
4、蛋白酶K——能够酶解样本中的各类蛋白质的酶
蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，在较广的pH范围（4〜12.5)内及高温 (50〜70°C)下均有活性，EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。用于质粒或基因组DNA、RNA的分离和抽提。在病毒核酸检测中，蛋白酶K是病毒采样液中的重要组分之一，蛋白酶K可以裂解病毒的外壳蛋白并使其失活，同时将病毒基因组释放以便后续进行核酸抽提。
5、UDG酶——高效控制PCR残余污染
尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），这种酶也称为尿嘧啶 -N- 糖基化酶或UNG酶。
因PCR是一种极敏感的扩增技术，易受污染的影响。小量的外源 DNA 污染可以与目的模板一块被扩增。卫生部明确规定，凡是用于临床检验的PCR试剂，都应该有UNG酶技术，以防止污染。由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
UDG酶的作用原理：在PCR产物或引物中用dU代替dT或者。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
热敏性UDG: 除了常规UDG外，现在也开发出热敏型UDG，热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白，又称南极热敏UDG，热敏型UDG在50℃ 5min即完全失活。大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA 糖基化酶较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA 糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。
6、限制性核酸内切酶——识别并剪切特定的脱氧核苷酸序列
限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。
常用的酶，如BsoB I, Hinc II，Nt.BstNBI切刻内切酶。其中，BD公司的链置换扩增术(stranddisplacement amplification,SDA)等温PCR系统中选择的酶需具有切割位点专一性，且对识别位点的化学修饰敏感。新冠疫情中Abbott 的明星产品ID NOW等温PCR系统中，就采用Nt.BstNBI内切酶。
7、解旋酶，helicase——使双链DNA变成单链DNA
利用ATP水解提供的能量来解开双链DNA核苷酸配对形成的氢键，从而形成单链DNA；
常用解旋酶：大肠杆菌的UvrD和T7噬菌体的gp4；大肠杆菌解旋酶II（UvrD），其解链速度是20bp/s，对反应速度有很大的制约性。T7噬菌体的解旋酶gp4解旋酶的解链速度更快，可达400bp/s，可以大大提高反应速度。
目前，Quidel等温PCR系统HAD中采用此酶
pcr体系中包含哪些试剂,各起什么作用呢
【PCR实验室设备清单】
一 试剂准备室
1 天平 欧莱博 MF1035C 万分位，精确度0.1mg
2 超净工作台 博科 BBS-DDC 垂直流单人单面
3 移液器 迈德飞 20-200ul 单道移液器可调
4 纯水机 欧莱博 OSJ-Ⅱ-30L 超纯水30L/h
5 低温冰箱 博科 BDF-25V270 ，-25℃立式270L
6 混匀仪 其林贝尔 BE-3100 2维混匀操控 适于多种混匀和漩涡振荡操作
7 药品冷藏箱 博科 BYC-310 2-8℃，310L单开门，
8 紫外消毒车 飞扬 ZXC 双管碳钢
二 样品制备室
1 生物安全柜 博科 BSC-1100ⅡB2-X 单人二级B2，(高全外排型，标配外挂风机+管道）
2 恒温水浴锅 欧莱博 HH-S4 双列四孔
3 低温冰箱 博科 BDF-25V270 ，-25℃立式270L
4 药品冷藏箱 博科 BYC-310 2-8℃，310L单开门，
5 离心机 博科 TG-16W 转速16600r/min，大容量6*100ml，
6 制冰机 博科 IMS-20 产冰量20kg，储冰量10kg
7 紫外消毒车 飞扬 ZXC 双管碳钢
8 低温摇床 欧莱博 OLB-110*30 恒温摇床制冷
9 移液器 迈德飞 20-200ul 单道移液器
三 扩增室
1 普通PCR基因扩增仪 朗基 朗基A300 普通pcr
2 荧光定量PCR仪 雅睿 雅睿 MA6000 荧光定量
3 核酸提取仪 爱森生物 BK-HS32 32通道磁棒磁性均一
4 移液器 赛多利斯 30-300ul 8道移液器，半支消毒型
5 药品冷藏箱 博科 BYC-310 2-8℃，310L单开门，
6 紫外消毒车 飞扬 ZXC 双管碳钢
7 超净工作台 博科 BBS-DDC 垂直流单人单面
四 产物分析室
1 电泳仪电源 六一 DYY-6C 双稳定时
2 琼脂糖水平电泳槽 六一 DYCP-31DN 适用于鉴定、分离、制备DNA，以及测定其分子量，
3 凝胶电泳分析系统 六一 WD-9413B 凝胶成像分析系统，130万像素，信噪比≥62db，
4 电热板 欧莱博 DB-Ⅱ 不锈钢电热板，远红外碳化硅加热技术，
5 超净工作台 博科 BBS-DDC 垂直流单人单面
6 紫外消毒车 飞扬 ZXC 双管碳钢
7 天平 欧莱博 MF1035C 万分位，精确度0.1mg，
8 杂交仪 汗诺 LF-Ⅲ 5-20r/min配酶标版震荡，振幅可调，数显连续可调，