免疫共沉淀flag作用(免疫共沉淀)
免疫共沉淀
chip指的是结合位点分析法,作为研究体内蛋白质与DNA相互作用。染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。
crisp一般指刘青松。 刘青松(游戏ID:Crisp),1998年8月20日出生于湖南省衡阳市,英雄联盟职业选手,司职辅助,现效力于FPX电子竞技俱乐部。
免疫共沉淀实验是检测蛋白与蛋白之间的相互作用
共免疫沉淀是基于抗原抗体特异性结合的原理,体外验证两种分子之间是否存在相互作用的技术。它是免疫沉淀的延伸,其基本原理是在含有已知抗原的细胞裂解液中,将已知抗原作为靶蛋白,检测裂解液中可能存在与之有相互作用的蛋白。
加入特定的抗体以及Protein A-Beads,会形成“抗原-抗体-Protein A-Beads”的复合物。
在抗原抗体特异性结合沉淀靶蛋白的同时,存在相互作用的蛋白也能被沉淀下来,最终得到“蛋白-蛋白”的复合物。验证是否有相互作用蛋白的存在。
免疫共沉淀磁珠
目前主要有普通培养法(简称国标方法)一般出报告的要用,仪器法、核酸检测法(PCR)、还有目前的快速检测法(主要包括:免疫磁珠、酶联免疫试剂盒、金标检测卡等。这个根据自己的需求来选择吧。
免疫共沉淀技术原理
检测目标基因活性在保持组蛋白和DNA联合的同时,染色质被切成很小的片断,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,将目标片段(组蛋白发生特异标记的片段)沉淀下来。
IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法(免疫磁珠结合proteinA,proteinA结合抗体Fc段,抗体结合抗原即发生特异标记的组蛋白,这里要注意组蛋白是和DNA结合的,这样就把目标组蛋白和DNA的符合物沉淀下来了)。
在将组蛋白与DNA分离,用获得的DNA去做western blot ,从而检测那些基因的组蛋白发生了修饰。
检测已知蛋白的靶基因在生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联在一起,超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而明确蛋白与哪些基因相互作用。
目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。
其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。
每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。
免疫共沉淀试剂盒
班氏试剂用于检测还原性糖的存在,它由柠檬酸钠,碳酸钠,硫酸铜组成,产生的Cu(OH)2与还原性糖反应,产生Cu2O砖红色沉淀。
糖原水解产物为葡萄糖,葡萄糖为还原性糖,所以班氏试剂可以和糖原反应产生Cu2O
免疫共沉淀结果图分析
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法,属于免疫沉淀技术的一类,常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。
免疫共沉淀的设计理念是,假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员,那么利用这种蛋白的特异性抗体,就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来(常说的“pull-down”),进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点,第一是天然状态,第二是蛋白复合。
免疫共沉淀原理
原理:免疫沉淀-质谱联用IP-MS技术
随着蛋白质组学技术的发展,将免疫亲和与质谱技术结合产生的IP-MS技术则逐渐显示出他的优势。原理是以细胞内源性靶蛋白为诱饵,将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育,促进免疫复合物的形成;随后加入能够与抗体结合的protein-A/G(预先结合固化在琼脂小珠上),形成”结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-proteinA/G小珠”复合物,纯化该复合物凝胶电泳分离蛋白,应用质谱分析鉴定靶蛋白的结合蛋白。
应用:免疫共沉淀与质谱结合,不仅能验证已知蛋白的相互作用,而且还可以鉴定与目标蛋白互作的未知蛋白,为科学研究提供全新的实验思路。